Kombinierte Computermodellierung und experimentelle Untersuchung der biomechanischen Mechanismen von Blutplättchen

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 869 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Während die Bildung von Blutgerinnseln relativ gut untersucht wurde, ist wenig über die Mechanismen bekannt, die der anschließenden strukturellen und mechanischen Umgestaltung des Blutgerinnsels zugrunde liegen, die als Kontraktion oder Retraktion bezeichnet wird. Eine Beeinträchtigung des Gerinnselkontraktionsprozesses ist sowohl mit lebensbedrohlichen Blutungen als auch mit thrombotischen Erkrankungen wie ischämischem Schlaganfall, venöser Thromboembolie und anderen verbunden. Kürzlich wurde beobachtet, dass die Kontraktion von Blutgerinnseln bei Patienten mit COVID-19 behindert ist. Ein dreidimensionales Multiskalen-Rechenmodell wird entwickelt und verwendet, um biomechanische Mechanismen der Kinetik der Gerinnselkontraktion zu quantifizieren, die durch Wechselwirkungen zwischen Blutplättchen und Fibrin verursacht wird. Diese Ergebnisse liefern wichtige biologische Einblicke in die Kontraktion von Blutplättchen-Filopodien, den mechanisch aktiven dünnen Vorsprüngen der Plasmamembran, von denen zuvor beschrieben wurde, dass sie hauptsächlich eine sensorische Funktion erfüllen. Die beschriebenen biomechanischen Mechanismen und der Modellierungsansatz können möglicherweise auf die Untersuchung anderer Systeme angewendet werden, in denen Zellen in ein filamentöses Netzwerk eingebettet sind und Kräfte auf die extrazelluläre Matrix ausüben, die durch die Substratsteifigkeit moduliert werden.

Blutgerinnsel sind gelartige Gebilde, die sich an Stellen von Gefäßverletzungen bilden, um die Blutung zu stoppen. Blutgerinnsel entstehen durch kombinierte zelluläre und enzymatische Reaktionen, an denen Blutplättchen und Plasmabestandteile, einschließlich Fibrinogen und andere Gerinnungsfaktoren, beteiligt sind. Zu den Hauptbestandteilen eines Blutgerinnsels gehört ein 3D-Polymer-Fibrinnetzwerk mit an Fibrinfasern befestigten Blutplättchen und roten Blutkörperchen, die in das poröse Netzwerk eingebettet sind. Nach der Bildung unterliegen Blutgerinnsel einer volumetrischen Schrumpfung durch einen Prozess, der als Gerinnselkontraktion oder -retraktion bezeichnet wird und durch aktivierte Blutplättchen1 angetrieben wird (siehe Abbildung 1, die die lokale Blutplättchenanhäufung und ein dreidimensionales Blutplättchenverdrängungsfeld eines kontrahierenden Gerinnsels zeigt).

a Serielles konfokales Bild, das die Bildung sekundärer Blutplättchencluster aufgrund der Annäherung blutplättchentragender Fibrinfasern während der Gerinnselkontraktion zeigt. Blutplättchen sind grün und Fibrin ist rot. Maßstabsbalken: 5 μm. b, c Repräsentative Bilder eines dreidimensionalen Blutplättchenverdrängungsfeldes eines kontrahierenden Gerinnsels; b Draufsicht, Fibrin (rot), Blutplättchen (grün) und Blutplättchenverschiebungsvektoren sind dargestellt; c perspektivische Ansicht, Blutplättchen (grün) mit ihren Verschiebungsvektoren werden visualisiert (Abbildung ist nachgedruckt von Kim et al. 16 unter den Bedingungen der Creative Commons CC BY-Lizenz).

Die intravitale Kontraktion von Blutgerinnseln oder Thromben hat mehrere wichtige pathophysiologische Auswirkungen, wie etwa die Verbesserung der Versiegelungseigenschaften von hämostatischen Blutgerinnseln2, die Verringerung der Gerinnselgröße und die Verbesserung des Blutflusses an ansonsten obstruktiven Thromben vorbei3, die Verhinderung von Gerinnselrupturen oder thrombotischen Embolisationen4 und die Veränderung der Anfälligkeit für Blutgerinnsel zur enzymatischen Lyse5. Dementsprechend ist eine Beeinträchtigung des Gerinnselkontraktionsprozesses mit lebensbedrohlichen thrombotischen Zuständen wie ischämischem Schlaganfall3, venöser Thromboembolie4,6 und anderen7 verbunden. Kürzlich wurde beobachtet, dass die Kontraktion von Blutgerinnseln bei Patienten mit COVID-19 behindert ist, insbesondere in schweren und tödlichen Fällen8.

Trotz ihrer klinischen Bedeutung sind die biomechanischen Mechanismen der Gerinnselkontraktion nicht vollständig verstanden. Es ist bekannt, dass die Kontraktion von Blutgerinnseln durch Zugkräfte angetrieben wird, die vom Blutplättchen-Zytoskelett erzeugt werden und über stark haftende Plasmamembranvorsprünge, sogenannte Filopodien, auf Fibrinfasern übertragen werden9. Einer der am wenigsten untersuchten Aspekte der Gerinnselkontraktion ist die Bildung von Thrombozytenfilopodien und deren physikalische Wechselwirkung mit dem Fibrinnetzwerk. Die Biomechanik der durch Blutplättchen verursachten Kontraktion von Blutgerinnseln ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis einer Vielzahl anderer, einigermaßen ähnlicher biologischer Prozesse im Zusammenhang mit der bidirektionalen zellulären Mechanotransduktion, einschließlich Zellmotilität, Geweberegeneration und -differenzierung10,11,12,13,14, Phagozytose9 und Krebsentstehung15. Die quantitative strukturelle Mechanobiologie der durch Blutplättchen verursachten Kontraktion von Blutgerinnseln hat sich in jüngster Zeit als neuer Weg der Biomechanik herausgestellt16 und kann eine Grundlage für das Verständnis des dynamischen und komplexen biomechanischen Zusammenspiels zwischen Nicht-Muskelzellen und den faserigen extrazellulären Matrizen unterschiedlicher Zusammensetzung bieten.

Die grundlegenden zellulären biomechanischen Mechanismen des Kontraktionsprozesses wurden erst in unserer Arbeit im Jahr 2017 aufgeklärt16. Insbesondere sind uns bis zu unserer ersten Beschreibung keine Arbeiten bekannt, in denen die Rolle der Streckung und Retraktion von Thrombozytenfilopodien bei der Gerinnselkontraktion untersucht wurde dieser Mechanismus16. Anders als bei anderen zellvermittelten physiologischen Prozessen9 ist der Mechanismus, der die Gerinnselkontraktion antreibt, nicht gut bekannt und wird nicht allgemein akzeptiert – weder in den relevantesten Arbeiten zur Blutplättchenbiomechanik17,18,19,20,21,22 noch in einer der neuesten und umfassendsten Übersichtsartikel zur Gerinnselkontraktion23 diskutieren die Rolle von Thrombozytenfilopodien bei der Gerinnselkontraktion. Daher ist die Rolle der Ausdehnung und Kontraktion von Blutplättchenfilopodien als treibende Kraft der Verdichtung des Fibrinnetzwerks nicht ganz klar und es lohnt sich, sie weiter zu untersuchen, einschließlich des Modellierungsansatzes, der es uns ermöglicht, mechanistische und quantitative Informationen über die Dynamik von Filopodien zu gewinnen, die experimentell nicht verfügbar sind.

In dieser Arbeit wird eine Kombination aus 3D-Rechnermodellsimulationen und experimentellen Beobachtungen verwendet, um wichtige mechanistische Einblicke in verschiedene Prozesse zu liefern, die an der Kontraktion von Blutgerinnseln beteiligt sind. Modellsimulationsergebnisse quantifizieren mikroskalige Mechanismen von Blutplättchen-Fibrinfaser-Wechselwirkungen, die an der Blutplättchenclusterung und der makroskaligen Gerinnselkontraktion beteiligt sind. Während das Modell eine Blutplättchen-Blutplättchen-Wechselwirkung zulässt, treten diese erst dann auf, wenn das Netzwerk ausreichend verdichtet wurde und an Fibrin befestigte Blutplättchen passiv in die Nähe zueinander bewegt werden. Wenn dies geschieht, beginnen die Blutplättchen aneinander zu haften und sekundäre Cluster zu bilden. Aktive Wechselwirkungen zwischen Blutplättchen und Blutplättchen, gefolgt von ihrer kompakten Packung, können während der Kontraktion von fibrinfreien hämostatischen Blutplättchenpfropfen, die in einigen experimentellen Modellen intravitaler Gefäßwandverletzungen gebildet werden, von wesentlicher Bedeutung sein24,25,26. Die Kontraktion solcher fibrinfreier Blutplättchenaggregate geht über den Rahmen dieser Arbeit hinaus, obwohl Elemente unseres Modells möglicherweise auf die mechanische und strukturelle Neuordnung aggregierter Blutplättchen in Abwesenheit von Fibrin anwendbar sind.

Viele charakteristische Merkmale von Blutgerinnseln und ihre dynamischen Eigenschaften können derzeit nicht experimentell gemessen werden. Beispielsweise kann die Aktivierung von Blutplättchen die Bildung von Filopodien in jedem Blutplättchen, die Anheftung einzelner Filopodien an Fibrinfasern, die Erzeugung von Zugkräften und das Zurückziehen von Filopodien, die Verkürzung von Fibrinfasern und die Netzwerkverdichtung usw. umfassen. Trennung und Quantifizierung jedes einzelnen davon Diese elementaren Schritte des Gerinnselkontraktionsprozesses sind kaum durchführbar, aber diese Merkmale können unabhängig voneinander sowie gemeinsam mithilfe eines mehrskaligen rechnerischen Ansatzes untersucht werden. Computermodellierung bietet die Möglichkeit, jede strukturelle und mechanische Komponente eines Blutgerinnsels quantitativ zu analysieren und die daraus resultierenden Auswirkungen auf die Kontraktion eines gesamten Blutgerinnsels zu integrieren.

Diese Arbeit zielt darauf ab, zu verstehen, wie aktivierte Blutplättchen die Kontraktion von Blutgerinnseln vorantreiben und die Gesamtdynamik des Prozesses durch Änderungen der Zugkräfte beeinflussen, die von ihren Filopodien ausgeübt werden, die die wichtigsten strukturellen und mechanisch aktiven Elemente eines kontrahierenden Blutplättchens sind. Ein Hauptkonzept, das dem in dieser Arbeit vorgestellten Modell zugrunde liegt, ist die Existenz einer biomechanischen Rückkopplung zwischen der Kontraktilität einzelner Blutplättchen (oder Filopodien) und der Dehnungsversteifung der Fibrinmatrix (oder einzelner Fibrinfasern)9,14,15. Das von unserer Gruppe entwickelte Modell verwendet insbesondere einen 3D-Computermodellierungsansatz, bei dem das Ausmaß der Blutplättchenaktivierung durch Änderung der Anzahl der Filopodien pro Blutplättchen und der Größe der von jedem Filopodien ausgeübten Kraft dargestellt werden kann. Wichtig ist, dass die durch Filopodien erzeugte Zugkraft durch die mechanische Reaktion auf die Änderung der Steifheit der Fibrinfasern unter Spannung moduliert wird. Diese Methodik ermöglicht die quantitative Darstellung verschiedener Thrombozytenaktivierungsmechanismen auf mikroskopischer Ebene und die Vorhersage der resultierenden Masseneigenschaften des Blutgerinnsels, wie etwa das Ausmaß und die Kinetik der Gerinnselkontraktion auf makroskopischer Ebene (siehe Abschnitt „Modellbeschreibung“). .

Die mechanischen Eigenschaften von Blutgerinnseln wurden ausführlich untersucht und es wurde gezeigt, dass sie von der Viskoelastizität ihrer Hauptbestandteile, d. h. Fibrin, Blutplättchen und roten Blutkörperchen, sowie vom strukturellen und mechanischen Zusammenspiel des Gerinnsels abhängen7,17,27,28,29,30 ,31. Fibrin spielt eine Schlüsselrolle bei der mechanischen Stabilität eines Gerinnsels, indem es ein Netzwerk bildet, ein Gerüst, das äußere Belastungen weiterleitet, die durch den Blutfluss oder extravaskuläre Kräfte sowie durch Zugkräfte aktivierter Blutplättchen während der Gerinnselkontraktion erzeugt werden29,32,33,34. Fibrinnetzwerke zeigen ein bemerkenswertes Versteifungsverhalten bei Dehnung und Scherung und einen Übergang zwischen Erweichung und Versteifung bei Kompression29,32,33,34. Einzelne Fibrinfasern weisen ein elastomeres Verhalten auf, was auf einen niedrigen Elastizitätsmodul (~MPa) hinweist, während sie gleichzeitig extrem dehnbar sind (>300 % Dehnung)35. Die Neigung von Fibringerinnseln zum Platzen wurde mittels thermodynamischer und struktureller Analyse36 untersucht und anhand der kritischen Energiefreisetzungsrate37,38 quantifiziert.

Blutplättchen spielen eine Schlüsselrolle bei der Kontraktion des Blutgerinnsels oder der Schrumpfung des Blutgerinnselvolumens, indem sie Zugkräfte auf die umgebenden Fasern ausüben, was zu einer Verdichtung des Fibrins in der Nähe einzelner Blutplättchen führt, was zu einer lokalen Verdichtung des Fibrins in einem Blutgerinnsel führt, was die Netzwerkdichte und die Blutgerinnselsteifigkeit dramatisch erhöht16. Die durchschnittliche maximale Kontraktionskraft, die von einem einzelnen Blutplättchen erzeugt wird, wurde mit 29 nN17 gemessen. Die Kontraktion des Gerinnsels geht mit dramatischen strukturellen Umlagerungen einher, so dass die roten Blutkörperchen im inneren Teil dicht gepackt sind, während sich an der Außenseite des Gerinnsels ein Netzwerk aus Fibrin und Blutplättchen ansammelt2,39. Diese strukturellen Veränderungen resultieren aus einem physikalischen Zusammenspiel zwischen mechanisch aktiven kontraktilen Blutplättchen und passiven viskoelastischen Elementen (rote Blutkörperchen, Fibrin) des komplexen und dynamischen biomechanischen Systems16,40. Die Kontraktion eines Blutgerinnsels verläuft in mehreren kinetischen Phasen, die von der molekularen und zellulären Zusammensetzung des Blutes abhängen, in dem sich ein Blutgerinnsel bildet41. Das Vorhandensein roter Blutkörperchen (RBCs) verändert die Kinetik der Gerinnselkontraktion und führt zur Bildung dicht gepackter polyedrischer Erythrozyten (Polyederozyten), die eine undurchlässige Barriere in kontrahierten Gerinnseln und Thromben bilden42.

Frühere theoretische und rechnerische Modelle der Blutgerinnselkontraktion untersuchten zwar die Rolle der Hauptkomponenten und wichtiger mechanischer Aspekte26,40,43,44,45,46,47,48,49, lieferten jedoch keine Beschreibung struktureller Details wie Fibrin Netzwerkorganisation und einzelne im Netzwerk eingebettete Blutplättchen50. Trotz wichtiger thermodynamischer Erkenntnisse40 sind die treibenden Kräfte und Mechanismen der strukturellen Neuordnung der kontrahierenden Blutgerinnsel nicht gut verstanden. Mehrere Computermodelle wurden kürzlich zur Untersuchung dieser Prozesse eingesetzt18,51, wobei der Schwerpunkt insbesondere auf dem asynchronen oder asymmetrischen Verhalten von Blutplättchen in einem sich zusammenziehenden Gerinnsel lag. Außerdem wurde in früheren Arbeiten43 ein wichtiges grobkörniges, molekulardynamisches, partikelbasiertes Modell zur Untersuchung der Bildung eines einzelnen Filopoden während der frühen Stadien der Blutplättchenaktivierung eingeführt.

Die Hauptneuheit des in diesem Artikel beschriebenen dreidimensionalen (3D) Multiskalen-Rechenmodellierungsansatzes liegt in seiner detaillierten Darstellung der Thrombozytenfunktionalität, an der Filopodien in verschiedenen Aktivierungsgraden beteiligt sind, mit entsprechenden lokalen strukturellen und mechanischen Veränderungen im Mikromaßstab, die einen kumulativen Einfluss auf die Makroskala haben die Kontraktion des gesamten Blutgerinnsels. Das Modell kombiniert ein mikroskaliges Untermodell des „Hand-über-Hand-an-einem-Seil-Ziehens“-Mechanismus eines Filopoden, der basierend auf der Steifheit der Faser an einer Fibrinfaser zieht, mit Untermodellen einer einzelnen Fibrinfaser und eines gesamten Fibrinnetzwerks. Außerdem untersuchen wir in dieser Arbeit den Kontraktionsprozess bei unterschiedlicher Anzahl von Filopodien pro Blutplättchen, da man bisher davon ausgegangen ist, dass Filopodien hauptsächlich eine sensorische Funktion erfüllen52,53, während Lamellipodien häufiger an der Krafterzeugung beteiligt sind.

Insbesondere beschreibt die aktuelle Arbeit detailliert den Umbau des Fibrinnetzwerks und die Ansammlung von Fibrin nahe der Oberfläche jedes aktivierten Blutplättchens während der Gerinnselkontraktion. Außerdem waren die meisten früheren Modelle der Mechanik von Biogelen darauf ausgelegt, die Dehnung und Verformung von Biogelen durch von außen auf ihre Oberflächen ausgeübte Kräfte zu simulieren. (Ein Beispiel für ein Modell, das die Dehnung eines Fibrinnetzwerks durch äußere Kräfte beschreibt, finden Sie in Lit. 30.) Nach unserem besten Wissen ist das in der aktuellen Arbeit beschriebene Modell das erste, das die ausgeübten inneren Kräfte detailliert berücksichtigt einzeln durch eine große Anzahl von Zellen (aktivierte Blutplättchen), die innerhalb eines Netzwerks positioniert sind und an einzelnen Fasern ziehen und lokal Fibrin kondensieren und das Netzwerk zusammenziehen. Dies führt zu Komplexität und biologischer Relevanz, ermöglicht die Kalibrierung des Modells anhand spezifischer experimenteller Daten und führt zu spezifischen prädiktiven Modellsimulationen.

Das Diagramm in Abb. 2 bietet eine Beschreibung der Kopplung aller Untermodelle in bestimmten Maßstäben in einem dreidimensionalen (3D) Multiskalen-Rechenrahmen zur Simulation der Gerinnselkontraktion. Abbildung 2 zeigt auch spezifische Vorhersageergebnisse, die durch die Verwendung einer Kombination aus biologisch kalibrierten Modellsimulationen und Experimenten erzielt wurden. Spezifische Parameterwertebereiche sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Dieses Multiskalenmodell kombiniert ein 3D-Modell eines Fibrinnetzwerks mit einem detaillierten Untermodell, das einen Filopoden eines einzelnen Blutplättchens darstellt, das an einer Fibrinfaser zieht und diese lokal verdichtet (Abb. 3a, Einschub). ). Einzelne Fibrinfasern werden mithilfe eines Masse- und Federmodellierungsansatzes beschrieben, der Faserdehnung, -biegung (Abb. 3b) und Faser-Faser-Kohäsionswechselwirkungen (Abb. 3c) umfasst (siehe auch Ergänzende Anmerkung 1 für weitere Modelldetails und Tabelle 1 für). Bereiche von Parameterwerten). Die anfängliche Konfiguration der Modellfibrinfasern und -plättchen ist so angeordnet, dass sie ein kugelförmiges Gerinnsel mit einem Radius von 23,8 µm darstellt (siehe Ergänzende Anmerkung 2). Diese Konfigurationen werden generiert, um experimentell messbare Eigenschaften wie Fibrin- und Blutplättchendichte sowie einen Teil des kolokalisierten Blutplättchenfibrins zu bewahren (siehe Ergänzende Anmerkungen 2.1–2.3).

Mikro- und mesoskalige Untermodelle kleinerer Phänomene werden als Komponenten zusammengesetzt und dann kalibriert, um ein Modell zu erstellen, das Daten auf der Mikro-, Meso- und Makroskala simulieren kann.

eine Momentaufnahme einer Modelldarstellung eines Fibrinnetzwerks (Linien) und Blutplättchen (Kugeln). (Einschub) Zu den Einflusszonen gehören die Filopodien-Interaktionszone (Region 1), die Klebezone (Region 2) und eine Thrombozytenvolumenzone, die den Thrombozytenkörper darstellt (Region 3). Pfeile zeigen an, ob die auf die Fasern ausgeübten Kräfte zur Mitte des Plättchens hin oder von der Mitte weg wirken. b Eine einzelne Fibrinfaser wird mithilfe mehrerer Worm-Like-Chain (WLC)-Untersegmentfedern und Biegefedern modelliert. Die Segmentierung der Faser in mehrere Federn wird durch Unterknoten angezeigt. Hier sind die Punkte i und j die Hauptknoten (z. B. Verzweigungspunkte, größere schwarze Knoten) für die Faser, während die Punkte zwischen i und j (z. B. p und n) rechnerische Unterknoten sind und die Segmente zwischen Unterknoten die sind WLC-Federteilsegmente (siehe Beispiel mit orangefarbenem Halo). c Diagramm der Bildung einer kohäsiven Bindung zwischen ausreichend engen Fasern (b und c wurden aus der Literatur30 mit Genehmigung von Elsevier geändert, um Bilder neuer Modellkomponenten aufzunehmen).

Basierend auf dem vorherigen, von unserer Gruppe entwickelten Modell30 wird jede Fibrinfaser als Segment zwischen zwei Knoten (Verzweigungspunkten in einem 3D-Fibrinnetzwerk) dargestellt und durch Unterknoten (virtuelle, willkürlich erstellte Punkte) in gleichmäßig beabstandete Untersegmente unterteilt Länge 0,3 µm, modelliert als nichtlineare, schneckenartige elastische Federn (Abb. 3b). Aufeinanderfolgende Teilsegmente weisen ebenfalls Biegekräfte auf, die durch lineare Biegefedern modelliert werden. Schließlich können Fasersegmente kohäsive Bindungen (kreuzende oder schräge Kontakte) bilden, wenn zwei nicht parallele Fasern/Segmente nahe beieinander liegen und sich berühren (Abb. 3c, weitere Einzelheiten finden Sie in der Ergänzenden Anmerkung 1.1 und in früheren Arbeiten30).

Die Dynamik von Faserknoten und Unterknoten wird durch eine Langevin-Gleichung in einem überdämpften Bereich beschrieben:

wobei \({x}_{{\rm {f}},j}\) der Positionsvektor des j-ten Faserknotens ist, \({F}_{{\rm {f}},j}\) ist die deterministische Kraft, die auf den j-ten Faserknoten oder Unterknoten wirkt (elastische Kräfte des Fibrins, Biegekräfte und Wechselwirkungskräfte zwischen Fibrin und Blutplättchen, siehe unten; Einzelheiten siehe Ergänzende Anmerkung 1.1), \({\eta }_{{\rm {f}}}\) stellt den Widerstandskoeffizienten für einen Faserknoten in flüssigem Serum dar und \({F}_{j}^{{{B}}}\) ist die Brownsche Kraft aufgrund thermischer Schwankungen (siehe Ergänzung). Weitere Einzelheiten finden Sie in den Anmerkungen 1.1). Die Bildung von Kohäsionsbindungen anstelle des Volumenausschlussprinzips in unserem Modell verhindert, dass sich Fibrinfasern kreuzen (weitere Einzelheiten finden Sie in der Ergänzenden Anmerkung 1.1 und in Lit. 30).

Die Federkonstante Bs der Biegefedern wird unter Verwendung der Beziehung Bs = EI berechnet, wobei E der Elastizitätsmodul ist, der durch Anpassen der Schneckenkettenkräfte an AFM-Daten aus der Literatur54 (siehe ergänzende Abbildung 1) bestimmt wurde. Der Parameter \(I\) ist das Trägheitsmoment eines Kreises. Weitere Einzelheiten zur Berechnung finden Sie in der Ergänzenden Anmerkung 3.1, die zu Bs = 2,252 × 10−3 nN μm2 führt.

Die relativ geringe Masse des Fibrins und der Blutplättchen sowie das relativ viskose Umgebungsmedium (dh eine Umgebung mit niedriger Reynolds-Zahl (<<1)) lassen die Annahme zu, dass die Dynamik einzelner Knoten wie in Lit. überdämpft ist. 30, daher entfällt der Trägheitsterm im System (1). Das System (1) wird dann diskretisiert und mithilfe eines Vorwärts-Euler-Schemas gelöst:

Eine ausführlichere Diskussion der Modellkräfte, Koeffizienten und Kalibrierung finden Sie in den Ergänzenden Anmerkungen 1.1 und 1.3.

Jedes Blutplättchen interagiert mit Fibrinfasern durch anhaftende Vorsprünge, sogenannte Filopodien, was zu einer Kontraktion des Gerinnsels führt, da Filopodien Fibrinfasern in Richtung des Zellkörpers ziehen. Dies wiederum führt zu einer Umgestaltung des Fibrinnetzwerks, was zu einer Fibrinakkumulation nahe der Oberfläche der Blutplättchen und einer Verdichtung des Fibrinnetzwerks führt, was die wichtigsten Strukturmerkmale der Gerinnselkontraktion darstellt. Durch die Verdichtung des Fibrinnetzwerks werden einige mit Fibrin verbundene Blutplättchen passiv nahe genug aneinander bewegt und bilden sekundäre Cluster.

Die Dynamik von Blutplättchen wird anhand der folgenden Langevin-Gleichungen beschrieben. Die Bewegung des Massenschwerpunkts des i-ten Plättchens wird nämlich durch die folgenden gewöhnlichen Differentialgleichungen beschrieben:

wobei \({F}_{{\rm {p}},i}\) die Summe der deterministischen Kräfte ist, die auf das i-te Plättchen wirken. Zu diesen Kräften gehören Fibrin-Blutplättchen- oder Blutplättchen-Blutplättchen-Wechselwirkungen (unten beschrieben, weitere Einzelheiten finden Sie in den Ergänzenden Anmerkungen 1.1–1.3). Die viskose Dämpfungskraft aufgrund der Füllung des Gerinnsels mit Serum wird durch \({\eta }_{{\rm {p}}}{\dot{x}}_{{\rm {p}} dargestellt, i}\) und \({F}_{i}^{{\rm {B}}}\) bezeichnet die Brownsche Kraft aufgrund thermischer Fluktuationen55 (Einzelheiten siehe auch Ergänzende Anmerkung 1.1). Es wird davon ausgegangen, dass sich das System wie bei Britton et al. in einem überdämpften Bereich befindet. 30. Der Trägheitsterm wird daher vernachlässigt und das System (3) wird mit einem Forward-Euler-Schema zeitlich diskretisiert:

wobei sich die hochgestellten Zeichen \(n\) und \(n+1\) auf die Vektormengen in den Zeitschritten \(n\) und \(n+1\) für das i-te Plättchen und \({{\rm {d }}t}\) ist der Zeitschritt; \({\eta }_{{\rm {p}}}\) stellt den Luftwiderstandsbeiwert für ein Blutplättchen mit festem Volumen im Plasma dar.

Filopodien aktivierter Blutplättchen sind vom Zytoskelett angetriebene Zellmembranvorsprünge, die sich an Fibrinfasern anheften und diese in Richtung der Blutplättchen ziehen können16. Die Fibrin-Blutplättchen-Bindung und -Traktion sind die wichtigsten Wechselwirkungen in den Modellsimulationen und der Hauptmechanismus für die Gerinnselkontraktion. Im Modell wird der Körper jedes aktivierten Plättchens als Kugel mit dem Radius \({r}_{\rm {{p}}}\) dargestellt (Abb. 4, Regionen 2 und 3). Darüber hinaus dehnt das Plättchen Filopodien im Bereich zwischen der Oberfläche des Plättchenkörpers (Kugel mit dem Radius \({r}_{{\rm {p}}}\)) und der Oberfläche einer Kugel mit dem Radius \({r) aus }_{{\rm {p}}}+{r}_{{{\rm {fil}}}}\) (Abb. 4, Region 1, auch als Filopodien-Interaktionszone bekannt), wobei \({ r}_{{{\rm {fil}}}}\) stellt die maximale Länge von Filopodien in Simulationen dar. Filopodien können sich innerhalb der Filopodien-Interaktionszone an Fibrinfasern und andere Blutplättchen anlagern. Eine kugelförmige Geometrie wird verwendet, da Blutplättchen unpolare Zellen sind und daher Formänderungen und Kräfte, die von aktivierten Blutplättchen auf ihre nahe Umgebung ausgeübt werden, isotrop sind.

Schematische Darstellung einer Modelldarstellung eines einzelnen Blutplättchens, das mit Fibrinfasern (schwarze Linien) in einem Gerinnsel interagiert. Abhängig vom Abstand zum Massenschwerpunkt der Plättchen wirken unterschiedliche Kräfte (Pfeile) auf Faserknoten oder Unterknoten (schwarze Punkte). Die dunkelblauen Pfeile stellen die Filopodien des Blutplättchens dar, die an zufällig ausgewählten Faserknoten innerhalb \({r}_{{\rm {{fil}}}}\) der Blutplättchenoberfläche ziehen (d. h. innerhalb der Filopodien-Interaktionszone, Region 1). Dabei ist \({r}_{\rm {{p}}}\) der Radius des (kugelförmigen) Plättchens und der Bruchteil \({f}_{\rm {{r}}}=0,9\). Wird verwendet, um die Klebezone, die Fibrin mit Adhäsionskräften hineinzieht (Region 2) (gelber Pfeil, der mit der Kraft \({F}_{0}\) zieht, vom Blutplättchenkörper (Region 3) zu unterscheiden, der durch Herausdrücken das Volumen von Fibrin ausschließt über ein Lennard-Jones-Potenzial \({F}_{{\rm {{LJ}}}}\). Detaillierte Ausdrücke für die Kräfte finden Sie in der Ergänzenden Anmerkung 1.1, Gleichungen (5)–(8).

Jedes Blutplättchen im Modell weist mehrere Filopodien auf, die zwischen 2 und 13 variieren (maximale Anzahl, die in Experimenten beobachtet wurde16, siehe auch Abb. 5). Die Anzahl für jedes einzelne Blutplättchen wird durch eine diskrete Zufallsvariable bestimmt, die aus einer verkürzten logarithmischen Normalverteilung generiert wird, die durch Anpassen an experimentelle Filopodienzahlen pro aktiviertem Blutplättchen erhalten wird (siehe Abb. 5). Jeder Filopod kann sich nur mit einer Fibrinfaser verbinden und zieht somit während der Kontraktion an einem Knoten oder Unterknoten. Dies geschieht, wenn ein Fibrinknoten oder -unterknoten in die blutplättchennahe Region gelangt, wo sich Filopodien ausbreiten können (Abb. 4, Region 1) und mindestens ein Filopodien verfügbar, aber noch nicht befestigt ist. In den Simulationen geht man davon aus, dass ein Knoten oder Unterknoten auf einer Fibrinfaser in diesen Bereich eintritt, wenn der Abstand zwischen dem Massenschwerpunkt des Knotens oder Unterknotens und dem Plättchen \({d}_{{\rm {{ fp}}}}\) erfüllt \({{r}_{\rm {{p}}} \, < \, {d}_{{\rm {{fp}}}} \, < \, r }_{\rm {{p}}}+{r}_{{{\rm {fil}}}}+{r}_{{{\rm {fib}}}}\, wobei \({ r}_{{{\rm {fib}}}}=0,05\,{\rm {\mu {m}}}\) ist der Radius einer Fibrinfaser30,54,56. Im Modell werden Hunderte von Fasern simuliert, die Hunderten von Segmenten entsprechen, was zusammen Zehntausende von Fibrinknoten und -unterknoten ergibt, während die verwendete Blutplättchendichte in den Simulationen 45 Blutplättchen entspricht, was Fibrin-Blutplättchen-Wechselwirkungen viel wahrscheinlicher macht Blutplättchen-Blutplättchen-Wechselwirkungen für die mit dem Modell simulierte Gerinnselkontraktion.

Die Wahrscheinlichkeitsdichtefunktionen der Anzahl der Filopodien pro Blutplättchen in 10 simulierten Blutgerinnseln wurden anhand spezifischer experimenteller Daten und in vier experimentell erhaltenen Blutplättchen-Fibrin-Netzwerken validiert.

Wenn sich ein Filopod an einem Fibrinknoten oder -unterknoten festsetzt, werden Kräfte entlang der Richtung ausgeübt, die die Massenschwerpunkte des Blutplättchens verbindet, das den Filopod und den Fibrinknoten oder -unterknoten ausdehnt. Die vom Filopod ausgeübte Kraft wird auf den Massenschwerpunkt des Fibrinknotens oder -unterknotens in Richtung des Massenschwerpunkts des Blutplättchens ausgeübt, das den Filopod ausdehnt (siehe Pfeile in Abb. 4). Eine entsprechende Reaktionskraft wird auch auf den Massenschwerpunkt des Plättchens ausgeübt, das den Filopoden in die entgegengesetzte Richtung verlängert. Faserknoten oder Unterknoten werden von Filopodien mit der Kraft \({F}_{\rm {{p}}}\ zum Plättchen gezogen, wenn sie sich in der Filopodien-Interaktionszone befinden (Abb. 4, Region 1). ). Eine konstante Adhäsionskraft (auf das Plättchen gerichtet), \({F}_{0}\), die die Adhäsion zwischen Fasern und Plättchenoberfläche darstellt, wird auf Faserknoten oder Unterknoten ausgeübt, wenn sie in die Klebezone (Region 2) eintreten ). Eine Lennard-Jones-Abstoßungskraft, \({F}_{{\rm {{LJ}}}}\) wird auf die Faserknoten und Unterknoten sowie auf die Blutplättchen ausgeübt, wenn sie in das Blutplättchenvolumen (Region 3) eintreten Erzwingen Sie den Volumenausschluss und verhindern Sie, dass sich Blutplättchen oder Fibrinfasern mit dem gegebenen Blutplättchen überlappen. Wenn Fasern in diesen Bereich gelangen, werden sie durch die Lennard-Jones-Kraft vom Massenschwerpunkt des Blutplättchens weggedrückt.

Modellsimulationen werden unter der Annahme durchgeführt, dass, sobald ein Filopod an einer Fibrinfaser befestigt ist, die Zugkraft eines Filopoden, \({F}_{{\rm {p}}}\, von der lokalen Steifheit der Faser abhängt an jedem gezogenen Knoten oder Unterknoten. Fibrin ist insbesondere ein spannungsversteifendes Material. Daher wird in unserem Modell die durchschnittliche lokale Dehnung der Faser am gezogenen Knoten oder Unterknoten zur Berechnung der lokalen Steifigkeit verwendet (siehe Ergänzende Anmerkung 3.1 und Ergänzende Tabelle 2 für die Kalibrierung einzelner Faser-Untermodelle).

Für jeden Knoten oder Unterknoten einer Faser, die von einem Filopoden gezogen wird, wird die lokale Faserdehnung \(\bar{\gamma }\) als durchschnittliche Dehnung aller Untersegmente berechnet, die diesen Knoten oder Unterknoten umfassen . Dann ist \(\bar{\gamma }\) die Faserdehnung, mit der der Filopod eine Zugkraft erzeugt. Die durchschnittliche lokale Steifigkeit einer an einem Filopoden (Knoten oder Unterknoten) befestigten Faser wird wie folgt berechnet: \(k=\frac{{\rm {d}}{F}_{{{\rm {WLC} }}}(\bar{\gamma })}{\bar{d\gamma }}\).

Die folgende Formel wurde an experimentelle Daten angepasst, um die von einem gesamten Blutplättchen ausgeübte Kontraktionskraft anzunähern:

Hier ist \(t\) die Zeit, die seit dem Beginn der Kontraktion (d. h. dem Beginn der Simulation) des Gerinnsels vergeht, und \({f}_{0},{a},{b},{c}, {d},\,\tau\) sind Parameterwerte, die durch Anpassen experimenteller Daten ermittelt werden17 (siehe Ergänzende Anmerkung 3.2, Ergänzende Tabelle 3, Ergänzende Abbildung 3 und Tabelle 1 für weitere Details und in Simulationen verwendete Parameterwerte). Formel (5) berücksichtigt sowohl die zuvor beobachtete exponentielle Belastungszeit17 als auch den monotonen Anstieg und die Sättigung der kontraktilen Zellkraft. Dies ähnelt dem, was in Lit. beobachtet wurde. 57, wo gezeigt wurde, dass Stammzellkräfte eine vergleichbare Abhängigkeit von der Steifheit ihrer umgebenden extrazellulären Matrix haben. Das vorliegende Modell umfasst jedoch ein Untermodell, das die Zugkraft eines einzelnen Filopoden darstellt, und derzeit sind keine experimentellen Daten verfügbar, die diese Kraft charakterisieren. Stattdessen haben wir mehrere hypothetische Ausdrücke getestet, um die Zugkraft eines einzelnen Filopoden \({F}_{{{\rm {Filopod}}}}\) aus \({F}_{{{\rm { Blutplättchen}}}}\) (Einzelheiten finden Sie in der Ergänzenden Anmerkung 3.2; ein Vergleich mit experimentellen Daten erfolgt in der Ergänzenden Anmerkung 4.3).

Die Funktion der Filopoden-Zugkraft, die die beste und sehr gute Übereinstimmung mit experimentellen Daten ergab, wird durch die folgende Formel angegeben:

Während der Filopodienkontraktion wirkt die ausgeübte Kraft nur auf Fibrinknoten oder Unterknoten einer Fibrinfaser, während \({{r}_{{\rm {p}}} \, < \, {d}_{{{\ rm {fp}}}} \, < \, r}_{{\rm {p}}}+{r}_{{{\rm {fil}}}}+{r}_{{{\rm {Flunkerei}}}}\). Wenn diese Bedingungen nicht erfüllt sind, löst sich der Filopod von der Fibrinfaser. Wenn für Blutplättchen-Fibrin-Wechselwirkungen der Abstand zwischen Fibrinknoten, Unterknoten und einem Blutplättchen stattdessen \({{d}_{{{\rm {fp}}}} \, < \, r}_{{ \rm {p}}}\) wird zunächst eine Adhäsionskraft und dann eine Volumenausschlusskraft angewendet (ausführlich im nächsten Unterabschnitt). Zusätzlich kommt es nach der Interaktion zwischen einem Filopoden und einer Fibrinfaser dazu, dass sich der Filopoden nach dem Ablösen wieder festsetzt und beginnt, am nächsten Knoten oder Unterknoten der Fibrinfaser zu ziehen. Diese Modellierungskomponente reproduziert den zuvor beobachteten Mechanismus „Hand über Hand an einem Seil ziehen“16. Wenn kein solcher neuer Fibrinknoten oder Unterknoten existiert (z. B. Endknoten einer Faser), bleiben die Filopodien frei und schwanken, um sich mit anderen verfügbaren Fasern zu verbinden.

Derzeit gibt es keine experimentellen Beweise dafür, zwischen dem anschließenden Ziehen an einer Faser durch verschiedene Plättchenfilopodien und dem wiederholten Ziehen an einer Faser durch denselben Filopodien zu unterscheiden. Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass dieser Unterschied beim Filopodienziehen aus biomechanischer Sicht von entscheidender Bedeutung für die Gerinnselkontraktion ist, da Blutplättchen in beiden Fällen den gleichen Arbeitsaufwand für die Verkürzung und Verdichtung der Fasern leisten, was daher keinen Einfluss auf die Ergebnisse des Modells hat.

Während der Gerinnselkontraktion zieht jedes Blutplättchen Fibrinfasern in Richtung seines Massenschwerpunkts. Im Modell wird ein Bruchteil des Plättchenradius, \({f}_{\rm {{r}}}=0,9\), verwendet, um die Grenze der Klebezone zu bezeichnen. Wenn der Abstand zwischen einem Blutplättchenzentrum und einem Fibrinknoten oder -unterknoten \({{f}_{{\rm {r}}}\cdot r}_{{\rm {p}}}+{r} _{{\rm {f}}} \, < \, {d}_{{{\rm {fp}}}} \, < \, {r}_{{\rm {p}}}+{ r}_{{\rm {f}}}\), dann befindet sich die Faser innerhalb der Klebezone, die das Plättchen umgibt. Wenn sich eine Fibrinfaser innerhalb der Klebezone eines aktivierten Blutplättchens befindet, übt das Modell eine feste konstante Kraft, \({F}_{0}\), auf die Massenschwerpunkte der Fibrinknoten oder -unterknoten aus, die auf das gerichtet sind Massenschwerpunkt des Blutplättchens. Die Adhäsionszonenkraft ist Teil des Blutplättchenzugs, der durch die Blutplättchen-Actomyosin-Maschinerie erzeugt wird, durch die die Kontraktilität über die Blutplättchenintegrine auf Fibrinfasern übertragen wird. Die Kontraktionskraft wurde für einzelne Blutplättchen mit verschiedenen experimentellen Methoden gemessen, die in Lit. beschrieben sind. 58,59,60. Wir haben den Minimalwert von \({F}_{0}\) aus der ergänzenden Abbildung 2 auf 4 nN geschätzt. Die Klebezone für die Plättchen ist in den Abbildungen dargestellt. 3a und 4 (Bereich 2). Diese Kraft tendiert dazu, die Faserfasern in der Klebezone näher an den Massenschwerpunkt des Blutplättchens zu bewegen. Einmal \({{d \, < \, f}_{{\rm {r}}}\cdot r}_{{\rm {p}}}+{r}_{{\rm {f}} }\), für Faserknoten und Unterknoten muss die 3D-Mechanik berücksichtigt werden. Um insbesondere die Rolle eines Blutplättchenkörpers widerzuspiegeln, wird eine abstoßende Kraft eingeführt, die Fibrinfasern vom Blutplättchen wegdrückt. Diese Art von Kraft wird oft als Volumenausschlusskraft bezeichnet61 und wird auf die Fibrinknoten und -unterknoten in die entgegengesetzte Richtung ausgeübt, dh vom interagierenden Blutplättchen weg. Diese Thrombozytenvolumenzone wird durch Region 3 in den Abbildungen dargestellt. 3a und 4. Die Kraftgröße wird unter Verwendung einer standardmäßigen potenziellen Lennard-Jones-Kraft \({F}_{{{\rm {LJ}}}}=12\epsilon ({\sigma }^{12}/) berechnet. {x}^{13}-{\sigma }^{6}/{x}^{7})\), wobei \(\sigma =2{{f}_{{\rm {r}}}r }_{{\rm {p}}}/{2}^{1/6}\), \(\epsilon =16\,{\rm {{nN}}}\cdot {\rm {\mu m }}\) und \(x={d}_{{{\rm {fp}}}}\,{{\rm {or}}}\,{d}_{{{\rm {pp}} }}\) (siehe auch Ergänzende Anmerkung 1.1 für Details zum Parameter). Da das Modellgerüst möglicherweise einige Filopodien unbeteiligt lässt und die Anzahl der Filopodien pro Blutplättchen auf die Anzahl der aktiv ziehenden Filopodien kalibriert wurde, ist es wichtig zu beachten, dass in unseren Simulationen alle verfügbaren Filopodien aktiv mit dem Ziehen von Fibrinfasern beschäftigt waren.

Zur Beschleunigung und Optimierung einer sehr großen Anzahl von Modellsimulationen wurden mehrere Rechentechniken eingeführt. Zunächst wurde der Simulationscode mit CUDA implementiert, um die GPU-Parallelisierung vollständig zu nutzen. Alle unabhängigen Vorgänge werden mithilfe der parallelen Algorithmenbibliothek CUDA Thrust parallel ausgeführt, um die Block- und Threadanzahl zu optimieren. Die GPU-Thread-Synchronisierung wurde speziell entwickelt, um Datenrennen zu vermeiden. Da alle Filopodien und Fasern in Simulationen interagieren müssen, werden zwei dreidimensionale Zellgitter mit unterschiedlichen Auflösungen verwendet, um Karten der nächsten Nachbarn zu erstellen. Diese Gittermethode reduziert die Kosten der Elementinteraktion von O(n2) auf O(n), was zu Skalierbarkeit und einer nahezu linearen Laufzeitverlängerung in Bezug auf die Elementanzahl führt. Weitere Kommentare zum Rechenaufwand des Modells und zur GPU-Parallelisierung finden Sie in der Ergänzenden Anmerkung 1.4. Die Durchführung einer Sensitivitätsanalyse erfordert Hunderte bis Zehntausende Modellsimulationen (z. B. varianzbasierte Methoden wie Sobol-Indizes; PRCC oder eFAST62,63), was derzeit rechentechnisch zu aufwendig ist. Daher haben wir unsere Analysen auf die freien Parameter beschränkt, bei denen wir festgestellt haben, dass sie am wahrscheinlichsten die größten biologischen Auswirkungen haben. Die in den Abbildungen im Abschnitt „Ergebnisse“ dargestellten Ergebnisse wurden durch Mittelung der Messungen von 10 simulierten Blutgerinnseln ermittelt. In den Abbildungen sind sowohl der Mittelwert als auch die Standardabweichung jeder aus diesen Simulationen berechneten Ausgabemetrik dargestellt. Wir können sehen, dass die Standardabweichung akzeptabel ist.

Wir weisen darauf hin, dass sowohl unser Modell als auch die in der Literatur20,51 beschriebenen Modelle für die Untersuchung der Fibringerinnselkontraktion entwickelt wurden und möglicherweise ähnlich erscheinen. Beispielsweise verwenden beide Modelle eine grobkörnige Darstellung von Fibrinfasern. Die veröffentlichten Modelle waren jedoch so konzipiert, dass sie sich in erster Linie mit speziellen Aspekten der Gerinnselkontraktion, der Heterogenität der Blutplättchen und der Beziehung zwischen den von einzelnen Blutplättchen erzeugten Kräften und der kontraktilen Gesamtkraft befassen. Darüber hinaus nutzen die Modelle20,51 trotz einiger scheinbarer Ähnlichkeiten die dissipative Teilchendynamik, um den Flüssigkeitseffekt (Viskosität) einzubeziehen, während unser Modell die Faser-Fluid-Wechselwirkung durch Einführung einer viskosen Dämpfungskraft und die thermische Fluktuation von Knoten durch die Brownsche Kraft berücksichtigt. Die Modelle20,51 stellen die Elastizität einzelner Fasern als harmonische Federn dar, während unser Modell einen nichtlinearen Worm-Like-Chain-Ansatz verwendet. Parameterwerte der Worm-Like-Chain werden durch Anpassung mit Messungen aus Rasterkraftmikroskopie-Experimenten erhalten. Da eine Fibrinfaser nichtlineare Kraft-Dehnungs-Profile aufweist, stellt die nichtlineare Wurmkette genau die lokale Dehnungs-Spannungs-Beziehung dar, die sich wiederum auf die Kraftmenge auswirkt, die ein Blutplättchen auf eine Faser ausüben kann. Modelle in der Literatur20,51 wenden Volumenausschlussenergien auf einzelne Faserknoten an, um zu verhindern, dass sie sich überlappen, und um nach der Initialisierung der Simulationen keine Kohäsionsbindungen zwischen Fasern zu bilden. Unser Modell bildet dynamisch Kohäsionsbindungen, wenn zwei Fasern nahe beieinander liegen, um zu verhindern, dass sie sich kreuzen. Diese Modelle20,51 geben jedem Blutplättchen genau 12 Filopodien, die jeweils mit einer linearen Kraft auf benachbarte Fasern ziehen (dh eine Kraft, die proportional zur Gerinnselkontraktion ist). Unser Modell verwendet eine probabilistische Verteilung für die Anzahl der Filopodien, die anhand experimenteller Daten ermittelt wurde.

Die lokale Faserverdichtung durch Plättchenziehen wird in diesen Modellen unterschiedlich modelliert. Unsere Arbeit erfasst die Verdichtung durch zwei Stellvertreter. Erstens handelt es sich um die zeitliche Gesamtentwicklung des Bereichs des mit Blutplättchen kolokalisierten Fibrins, und zweitens um die Bildung von Blutplättchenclustern, die mit der lokalen Verdichtung des Fibrins zusammenfallen. Andere Modelle20,51 messen die Verdichtung des Fasernetzwerks anhand des Volumens und der Querschnittsfläche. Bei Simulationen besteht ein weiterer Unterschied zwischen der Arbeit51 und dieser Arbeit darin, dass wir die Kontraktion von Blutgerinnseln und die Bildung von Blutplättchen betrachten und die Schrumpfung eines Blutgerinnsels in quasistationären Zuständen bestimmen; Das iClot-Framework51 untersucht die entstehende makroskalige Kraft, die ihr Gerinnsel auf Grenzwände ausübt, und den Einfluss der zeitlichen Asynchronität der Blutplättchenkontraktion auf das Gerinnselvolumen. In der vorherigen Arbeit20 werden auch die Querschnittsfläche von Blutgerinnseln und die Vernetzungskonzentration (dh die Entwicklung der volumetrischen Konzentration einer statischen Anzahl von Fibrin-Faser-Übergängen) als Maß für die Kontraktion betrachtet. Im Gegensatz dazu messen wir die Thrombozytenclusterung direkt aus der Simulation über einzelne Thrombozytenstandorte. Beide Arbeiten20,51 stellen Systeme mit Gerinnseln dar, die an zwei festen Grenzen befestigt sind, während unsere Simulationen freie Grenzen haben.

Simulationen wurden für kugelförmige Gerinnsel mit einem Radius von 23,8 µm durchgeführt, die biologisch relevant und so groß wie möglich ausgewählt wurden, um die Simulationen in angemessener Zeit abzuschließen. Wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben, wurden verschiedene Formen der Zugkräfte eines Filopoden getestet und die am besten passenden experimentellen Daten ausgewählt (Einzelheiten finden Sie in den Ergänzenden Anmerkungen 3.2 und 4.3). Für jede Form der Kraft führten wir 10 Gerinnselkontraktionssimulationen mit festen Parameterwerten durch, die in Tabelle 1 angegeben sind, mit unabhängig generierten anfänglichen Gerinnselstrukturen. Durchschnittliche und Standardabweichungen für jede Kontraktionsmetrik sind in Abb. 6 dargestellt. Bei diesen Gerinnselsimulationen handelt es sich um 45 kugelförmige Blutplättchen, die in Fibrinnetzwerke eingebettet sind, und sie werden 30 Minuten lang in der tatsächlichen Kontraktionszeit ausgeführt. Jedes Gerinnsel wurde rechnerisch mit einer durchschnittlichen Thrombozytendichte von 800.000 Thrombozyten/mm3 erzeugt, was einer Thrombozytenkonzentration in plättchenreichem Plasma (doppelt so hoch wie die höchste normale Thrombozytenzahl im Vollblut, um das Erythrozytenvolumen zu berücksichtigen)64 und 0,3 % Fibrinvolumen entspricht Anteil entsprechend einer normalen Massenkonzentration von Fibrinogen im Plasma 0,2–0,4 %65.

Simulationsergebnisse werden durch blaue gestrichelte Linien dargestellt, während schwarze durchgezogene Linien experimentelle Daten darstellen16. Die schattierten Bereiche stellen das Intervall zwischen dem Mittelwert plus einer Standardabweichung und dem Mittelwert minus einer Standardabweichung dar. a Normalisierte Fläche von plättchenkolokalisiertem Fibrin, \({f}_{{\rm {p}}}/{f}_{{\rm {p}}}^{0}\), während der Gerinnselkontraktion. b Normalisierte Fibrindichte, \({f}_{{\rm {d}}}{/f}_{{\rm {d}}}^{0}\) als Funktion der Zeit. c Änderungen der Fibrindichte, \({\varDelta f}_{{\rm {d}}}\) während der Gerinnselkontraktion (die erste Ableitung von \({f}_{{\rm {d}}}{/ f}_{{\rm {d}}}^{0}\)). Die Ergebnisse werden als M ± STD aus 10 Simulationen dargestellt (Einzelheiten zu Kontraktionsphasenberechnungen finden Sie auch in der Ergänzenden Anmerkung 4.1 und in der Ergänzenden Abbildung 4).

Der Anteil an Fibrin, der in der Nähe von Blutplättchen initialisiert wurde, \({P}_{{{\rm {fnp}}}}\), wurde auf 0,5 festgelegt (siehe Ergänzende Anmerkung 2.1), da dies der Anteil war, der simulierten Netzwerken entsprach, die größer waren qualitativ wie die aus Experimenten. Beachten Sie, dass diese Faserdichten und Blutplättchendichten innerhalb des gewählten Gerinnselvolumens zu über 60.000 möglichen Befestigungspunkten (Knoten und Unterknoten) für Filopodien auf Fibrinfasern führen. Der durchschnittliche anfängliche Abstand zwischen den Blutplättchen beträgt in unseren Simulationen 25 Mikrometer. Daher sind Blutplättchen-Blutplättchen-Wechselwirkungen selten und treten nur dann auf, wenn zwei Blutplättchen während der Netzwerkverdichtung während der Gerinnselkontraktion sehr nahe aneinander gebracht werden. Die Verteilung der Filopodienzahlen pro Blutplättchen aus vier unabhängigen Experimenten zur Bildgebung und Analyse von mehr als 400 Blutplättchen ist in Abb. 5 als hellgraue Rechtecke dargestellt. Die in den Simulationen verwendete angepasste Lognormalverteilung (\(\mu =1,85\),\(\sigma =0,27\)) wird als dunkelgraue Rechtecke angezeigt. Simulierte Thrombozyten-Filopodienzahlen, die in Simulationen verwendet wurden, wurden durch Probenahme dieser logarithmischen Normalverteilung erhalten, die mithilfe der experimentell beobachteten Verteilungen angepasst wurde (wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben).

Die Anzahl der Filopodien hängt vom Ausmaß der Thrombozytenaktivierung und der Dynamik des Zytoskeletts ab, unabhängig von der Menge des umgebenden Fibrins. Die Thrombozyten-Fibrin-Bindung ist probabilistisch: Je höher die Fibrindichte ist und je mehr Filopodien gebildet werden, desto wahrscheinlicher ist es, dass sie interagieren. Das Modell impliziert, dass alle Filopodien beteiligt sind, und dies ist eine sinnvolle Vereinfachung. Da darüber hinaus nicht viele Daten über die genaue Verteilung der Fasern vorliegen, mit denen Blutplättchen ihre Filopodien verbinden, erlauben wir ihnen, zufällig unter den Fasern in ihrer Reichweite auszuwählen. Unser Modellrahmen kann leicht erweitert werden, um alternative Hypothesen darüber aufzunehmen, wie Blutplättchen entscheiden könnten, welche Fasern gezogen werden sollen.

Um das Modell zu validieren, wurden Simulationen der Gerinnselkontraktion mit experimentellen Daten von Kim et al. verglichen. 16 unter Verwendung mehrerer geeigneter Metriken zur Quantifizierung der Gerinnselkontraktion im Laufe der Zeit (Abb. 6). Zu den in Abb. 6a–c verwendeten Metriken gehört die relative Fläche von plättchenkolokalisiertem Fibrin auf der Oberfläche der simulierten Blutplättchen (d. h. der Fibrinanteil, der innerhalb der Zonen 2 oder 3 eines beliebigen Blutplättchens liegt, wie in Abb. 4 beschrieben) \({ f}_{\rm {{p}}}\); Fibrinfaserdichte, \({f}_{\rm {{d}}}\); und Änderung der Fibrindichte, \(\varDelta {f}_{\rm {{d}}}\). Abbildung 6 zeigt, dass die simulierten Ergebnisse innerhalb eines einzelnen Standardabweichungsbereichs der experimentellen Messungen liegen. Insbesondere sagt das Modell korrekt einen Anstieg der von einzelnen Blutplättchen angesammelten Fibrinmenge voraus, da diese an den Fibrinfasern ziehen und die Fasern verdichten (Abb. 6a). Die berechneten Veränderungen der Fibrindichte zeigen einen 1,4-fachen Anstieg nach 30 Minuten Kontraktion, was mit den experimentellen Daten übereinstimmt (Abb. 6b).

Diese Vergleichsergebnisse bestätigen das vorgeschlagene Modell der Gerinnselkontraktion. In früheren experimentellen Studien16 wurden drei unterschiedliche kinetische Phasen bei der Gerinnselkontraktion beobachtet. Dies sind „Vorkontraktion“ oder Verzögerungsperiode (Phase P1), „aktive Kontraktion“ (Phase P2) und „Endkontraktion“ (Phase P3). Änderungen in der ersten Ableitung der Fibrindichtefunktion in Bezug auf die Zeit weisen auf drei kinetische Phasen hin, die sowohl in vitro als auch in silico zu kontrahierenden Blutplättchen-Fibringerinnseln führen (siehe Abb. 6c und Ergänzende Anmerkung 4.1).

Die Zeiten der Veränderungen von einer Phase zur anderen werden durch die beiden Hauptpeaks der Fibrindichteänderungen (Maxima in der ergänzenden Abbildung 4) identifiziert, die drei kinetische Phasen der Gerinnselkontraktion implizieren, die zuvor als „Vorkontraktion“ und „aktiv“ bezeichnet wurden. und „letzte“ Kontraktionsstadien16. Bemerkenswerterweise liegen die kinetischen Phasengrenzen für das Modellgerinnsel bei t = 3,0 ± 1,0 min und t = 33,0 ± 1,0 min sehr nahe an den zeitlichen Grenzen für experimentelle Gerinnsel bei t = 4,2 ± 1,2 min und t = 29,4 ± 1,2 min. Die kinetischen Raten (d. h. die durchschnittliche Änderung der Fibrindichte während einer Phase) der drei aufeinanderfolgenden Kontraktionsphasen, die im Modell berechnet wurden: k1 = 0,015/s, k2 = 0,010/s und k3 = 0,011/s, stimmen ebenfalls teilweise mit überein die entsprechenden experimentellen Werte k1 = 0,024/s, k2 = 0,011/s, k3 = 0,0044/s. Insbesondere ist die kinetische Geschwindigkeit der „aktiven“ Phasen für Experimente und Simulationen nahezu identisch.

Um das Modell weiter zu validieren, führten wir Experimente zur makroskopischen Kontraktion von Blutgerinnseln aus plättchenreichem Plasma in Abwesenheit und Anwesenheit von Blebbistatin, einem Inhibitor von Myosin IIA (siehe Abschnitt „Methoden“), durch und verglichen sie mit den entsprechenden Simulationen wobei die Wirkung von Blebbistatin durch eine 10-fache Verringerung der Thrombozytenzugkraft nachgeahmt wurde. Die experimentellen und simulierten Kurven der Gerinnselkontraktionskinetik stimmen quantitativ und qualitativ überein (ergänzende Abbildung 11).

Schließlich haben wir festgestellt, dass in Modellsimulationen nach der Bildung von Blutplättchenclustern hochbelastete Fibrinbündel entstehen, die sich zwischen Blutplättchenclustern mit einer räumlichen Größenordnung von mehreren zehn Mikrometern bilden (Abb. 7 und Zusatzfilme 1–4). vorher beobachtet66. Die ergänzenden Filme 1–4, die ergänzende Anmerkung 4.5 und die ergänzende Abbildung 10 zeigen auch die Lokalisierung der Dehnung in Bündeln in Modellsimulationen.

Simulierte Gerinnselkonfiguration bei \(t=0\) Minuten (a) und t = 45 Minuten (b) und eine Nahaufnahme kleiner Modellelemente (c). Jede große Kugel stellt den Körper eines Blutplättchens in einem kugelförmigen Gerinnsel mit dem Anfangsradius \(25\,{\rm {\mu m}}\) dar, das aus Fibrinfasern besteht (Linien und kleine weiße Unterknoten in (c)). . Die kleinen grünen Linien stellen die Filopodien dar und die kleinen grünen Kugeln zeigen den Punkt der aktiven Verbindung zwischen Filopodien und Fibrin. Wärmer gefärbte Blutplättchen üben insgesamt mehr \(|{F}_{{{\rm {Filopod}}}}|\) auf ihr umgebendes Netzwerk aus. Zur besseren Sichtbarkeit sind die einzelnen Fibrinfaser-Unterknoten in (a) und (b) nicht dargestellt, aber die zwischen ihnen gezogenen Linien sind je nach Faserdehnung von niedriger Dehnung (kühlere Farben) bis zu höherer Dehnung (wärmere Farben) gefärbt. Darüber hinaus wurde die Opazität von Fasern mit geringer Dehnung in (a–d) verringert, um die Betrachtung der Blutplättchenverteilung zu erleichtern. b zeigt die Entstehung hochbeanspruchter Faserbündel. Panel c ist eine Nahaufnahme mehrerer Blutplättchen innerhalb des simulierten Gerinnsels und zeigt einzelne Fibrin-Unterknoten in Weiß. Dieses Panel zeigt die Ansammlung von Fibrin am Körper der Blutplättchen. Panel d zeigt eine 2D-Projektion einer Seitenansicht eines Gerinnsels, das digital in zwei Hälften geschnitten wurde, und zeigt die innere Spannungsverteilung, die hauptsächlich in Bündeln zwischen Blutplättchenclustern lokalisiert ist, und komprimiertes Fibrin, das an den Blutplättchenwänden haftet.

Es wurde gezeigt, dass Blutplättchen unter verschiedenen Bedingungen unterschiedlich stark aktiviert werden, was zu mehr oder weniger Filopodien pro Blutplättchen führt67,68. Die Anzahl der Filopodien pro Blutplättchen ist in unserem Modell ein Indikator für die Blutplättchenaktivierung, den wir leicht kontrollieren können. Um den Einfluss der Anzahl einzelner Filopodien zu bewerten und zu quantifizieren, wurde die Gerinnselkontraktionsrate zusätzlich zu den im Unterabschnitt „Modellvalidierung“ dargestellten Messwerten über eine 30-minütige Kontraktion in Gerinnseln berechnet, die mit unterschiedlicher Anzahl von Filopodien pro Blutplättchen erzeugt wurden. Alle anderen Modellparameter (Tabelle 1) blieben unverändert. Die Gerinnselkontraktion wurde mit der Anzahl der Filopodien simuliert, die der experimentell beobachteten Verteilung entnommen wurden (Abb. 5). Die Verteilung mit einer geringeren Anzahl von Filopodien entspricht einem geringeren Grad der Thrombozytenaktivierung. Umgekehrt entspricht die Verteilung mit einer höheren Anzahl von Filopodien einem höheren Grad der Thrombozytenaktivierung67,68. Abbildung 8 zeigt die Ergebniswerte der im vorherigen Abschnitt vorgestellten Metriken, die aus simulierten Blutgerinnseln für Blutplättchen mit den experimentell beobachteten Verteilungen der Filopodienzahlen berechnet und mit den rechnerisch abgeleiteten Filopodienzahlen verglichen wurden, die sowohl niedriger als auch höher als die experimentellen Werte sind (Abb. 8a–c).

Simulationen mit experimentell beobachteten mittleren Filopodienzahlen werden durch blaue durchgezogene Linien dargestellt, während grüne gestrichelte Linien und rote gepunktete Linien Simulationen der Gerinnselkontraktionskinetik mit niedrigeren bzw. höheren Filopodienzahlen darstellen. Die schattierten Bereiche stellen das Intervall zwischen dem Mittelwert plus einer Standardabweichung und dem Mittelwert minus einer Standardabweichung aus N = 10 simulierten Gerinnseln dar. a Bereich des durch Blutplättchen kolokalisierten Fibrins, b Faserdichte und c Änderungen der Faserdichte im Laufe der Zeit (Einzelheiten zu den Berechnungen der Kontraktionsphasen finden Sie auch in der Ergänzenden Anmerkung 4.2 und in der ergänzenden Abbildung 5).

Die auf der Fibrinverdichtung basierenden Geschwindigkeiten und Ausmaße der Gerinnselkontraktion korrelierten mit dem Grad der Co-Lokalisierung von Fibrin mit Blutplättchen. In Simulationen wird die Faserdichte bei Simulationen mit niedrigen Filopodienzahlen (\(\mu =0,9\) und \(\sigma =0,19\)) um etwa 10 % und bei Simulationen mit hohen Filopodienzahlen um mehr als 55 % erhöht ( \(\mu =3,7\) und \(\sigma =0,38\)), während Blutplättchen mit den experimentell beobachteten Zwischenzahlen von Filopodien (\(\mu =1,85\),\(\sigma =0,27\)) ~ verursachen 30 % Verdichtung (Abb. 8b). Abbildung 8a zeigt, dass Blutplättchen mit der experimentell beobachteten mittleren Filopodienzahl im Verlauf der Gerinnselkontraktion die Menge an plättchenkolokalisiertem Fibrin um das 8-fache erhöhen, während Blutplättchen mit niedrigen und hohen Filopodienzahlen einen 5- bzw. 10-fachen Anstieg erreichen bei der Co-Lokalisierung von Fibrin. Somit zeigten die Simulationsergebnisse (Abb. 8), dass eine Erhöhung der Anzahl der Filopodien pro Blutplättchen zu einer schnelleren Gerinnselkontraktion, mehr blutplättchenassoziiertem Fibrin und einer höheren Faserdichte führte.

Bemerkenswerterweise wiesen die simulierten Blutplättchen enthaltenden Blutgerinnsel mit den experimentell beobachteten Filopodienzahlen absolute Kontraktionsmetrikwerte auf, die näher an denen lagen, die in Experimenten beobachtet wurden16 (siehe auch Abb. 6), während die simulierten Blutgerinnsel mit niedrigeren oder höheren Filopodienzahlen pro Blutplättchen reduziert oder verstärkt wurden Kontraktion, wie in Abb. 8 zu sehen ist. Diese Korrelation liefert ein weiteres Argument für die experimentelle Validierung des Modells, das zur Simulation der Kinetik der Gerinnselkontraktion angewendet wird.

Modellsimulationen legen daher nahe, dass die Anzahl der kontrahierenden Filopodien pro Blutplättchen ein wichtiges Merkmal ist, das die Phasenkinetik der Gerinnselkontraktion und ihre biomechanische Komplexität bestimmt. Blutplättchen mit einer verringerten Anzahl kontraktiler Filopodien führen zu einer beeinträchtigten Gerinnselkontraktion mit einer einzigen kinetischen Phase, während eine Erhöhung der Anzahl kontraktiler Filopodien pro Blutplättchen zu einer Gerinnselkontraktion führt, die durch drei oder mehr kinetische Phasen gekennzeichnet ist, was einen komplexeren biomechanischen Mechanismus der Blutgerinnsel widerspiegelt Kontraktion, wenn die Blutplättchen stärker aktiviert sind.

Es wurde bereits früher gezeigt16, dass sich die Abstände zwischen den Blutplättchen in kontrahierenden Blutgerinnseln während der Kontraktion zunehmend verringern, was zur Bildung sekundärer Blutplättchencluster führen kann, die die Kontraktion potenziell verstärken können. Modellsimulationen zeigten auch die Fähigkeit von Blutplättchen, sich während der Fibringerinnselkontraktion zusammenzuballen. Einzelne Blutplättchen waren zunächst gleichmäßig in einem Gerinnsel mit einem durchschnittlichen Abstand zwischen den Blutplättchen von 25 μm verteilt. Als Folge der Verdichtung des Fibrinnetzwerks während der Gerinnselkontraktion bildeten Blutplättchen Cluster, die aus zwei oder mehr Zellen bestanden (Abb. 9a). Innerhalb von 10 Minuten der Gerinnselkontraktion bildeten sich die meisten Blutplättchen zu Zwillingen, und später nahm die Anzahl der Cluster und ihre Größe zunehmend zu. Zwischen 10 und 30 Minuten nahm der durchschnittliche Anteil der Cluster aus zwei Blutplättchen ab, während der Anteil der Cluster mit drei, vier, fünf und sechs Blutplättchen um 30 %, 160 %, 250 % bzw. 100 % zunahm (Abb. 9b). Etwa 40 Minuten nach Beginn der Gerinnselkontraktion überstieg die Anzahl der gebündelten Blutplättchen den Anteil der einzelnen Blutplättchen im Gerinnsel (Abb. 9a).

a Verhältnisse der Anzahl einzelner Blutplättchen (gestrichelte blaue Linie) und Blutplättchen in Clustern (2 oder mehr Blutplättchen, schwarze durchgezogene Linie) während der Gerinnselkontraktion. Durchgezogene Linien stellen Mittelwerte dar, schattierte Bereiche zeigen die Standardabweichung vom Mittelwert an, N = 10 Simulationen. b Histogramme der Anzahl der Blutplättchen pro Cluster, bestehend aus 2–6 Blutplättchen, die sich im Verlauf der Kontraktion in simulierten Blutgerinnseln gebildet haben. Zeitpunkte: 10 (blau), 20 (orange), 30 (grau) und 40 (gelb) Minuten. c Histogramm der Verteilung von Blutplättchenclustern in verschiedenen normalisierten Abständen vom Zentrum (normalisiert in Bezug auf den Gerinnselradius vor der Kontraktion), beobachtet in der Simulation. Zeitpunkte: 10 (blau), 20 (orange), 30 (grau) und 40 (gelb) Minuten.

Abbildung 9c stellt die Häufigkeit von Blutplättchenclustern in Bezug auf ihren Abstand vom Gerinnselzentrum zu den Zeitpunkten t = 10, 20, 30 und 40 Minuten nach Beginn der Gerinnselkontraktion dar. Daher sagen unsere Simulationen voraus, dass sich Cluster zunächst näher am Rand des Gerinnsels bilden. Insbesondere treten Blutplättchencluster häufiger in Domänen auf, die weiter vom Zentrum entfernt sind und näher an der Grenze des Gerinnsels liegen (Ergänzende Anmerkung 4.4 und Ergänzende Abbildungen 7–9 für weitere Einzelheiten). Mit fortschreitender Gerinnselkontraktion verschieben sich die Clusterpositionen näher zum Kern des Gerinnsels (Abb. 9c), was die makroskopische Schrumpfung des Gerinnsels vom Rand zur Mitte hin widerspiegelt. Dieses Simulationsergebnis stimmt mit der experimentell beobachteten Ausbreitung der Kontraktionsfront von der Grenze zum Zentrum des Gerinnsels überein16,51.

Multiskalige Rechenmodelle, die Wechselwirkungen zwischen Zellen und extrazellulären Matrizen beschreiben und anhand spezifischer experimenteller Daten kalibriert werden, spielen eine wichtige Rolle bei der Untersuchung der Biomechanik von Zellen und Geweben sowie der Embryonalentwicklung und der Krebsinvasion69,70,71,72. Insbesondere wurden mehrere theoretische und rechnerische Modelle entwickelt, um die Eigenschaften von Fibrin und die Strukturmechanik von Fibrinnetzwerken auf verschiedenen räumlichen Skalen zu simulieren28,30,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82 ,83,84,85. Detaillierte rechnerische mechanische Modelle von Blutplättchen und roten Blutkörperchen wurden in Lit. beschrieben. 86,87. Auch die Stabilität eines Gerinnsels unter verschiedenen Strömungsbedingungen unter Verwendung von Mehrphasenmodellen wurde zuvor in Lit. untersucht. 84,88,89,90.

Während die Bildung von Blutgerinnseln relativ gut untersucht wurde, ist wenig über die Mechanismen bekannt, die den nachfolgenden komplexen Prozessen der strukturellen und mechanischen Umgestaltung von Blutgerinnseln zugrunde liegen, die als Kontraktion oder Retraktion bezeichnet werden und von hoher pathophysiologischer Bedeutung sind. Die Kontraktion des Blutgerinnsels wird durch aktivierte Blutplättchen vorangetrieben, die an Fibrinfasern ziehen, was zu einer Verringerung des Blutgerinnselvolumens führt. Die von Kim et al. 16 legten eine quantitative Strukturbasis für die Mechanobiologie der Blutgerinnselkontraktion fest. Menschliche Blutplättchen-reiche Plasmagerinnsel wurden auf verschiedenen räumlichen Skalen experimentell untersucht, wobei ein besonderer Schwerpunkt auf Wechselwirkungen zwischen einzelnen Blutplättchen und einzelnen Fibrinfasern und ihren Auswirkungen auf die Kinetik der Gerinnselkontraktion auf makroskopischer Ebene lag. In dieser Arbeit wurden experimentelle Beobachtungen durch mehrskalige Computermodelle ergänzt und weiterentwickelt, um wichtige mechanistische Einblicke in die Kontraktion und strukturelle Umgestaltung von Blutgerinnseln zu liefern.

Das in Abb. 2 beschriebene Multiskalen-Modellierungsgerüst zur Simulation der Gerinnselkontraktion kombiniert ein mikroskaliges Untermodell des „Hand-über-Hand an einem Seil ziehenden“ Mechanismus eines Filopoden, der an einer Fibrinfaser zieht, basierend auf der Steifheit der Faser mit a mesoskaliges Untermodell des Fibrinnetzwerks. Das Modell wurde anhand spezifischer experimenteller Daten validiert, indem sowohl für Experimente als auch für Simulationen ähnliche kinetische Raten der „aktiven“ Kontraktionsphasen nachgewiesen wurden. Anschließend wurde mithilfe von Modellsimulationen die Fibrinverdichtung/-akkumulation in der Nähe einzelner Blutplättchen und Blutplättchenaggregate erfolgreich quantifiziert. Außerdem haben wir in dieser Arbeit die Anzahl der Filopodien pro Blutplättchen variiert und vorhergesagt, wie eine erhöhte oder verringerte Anzahl von Filopodien pro Blutplättchen den Kontraktionsprozess beeinflussen könnte. Darüber hinaus zeigten Modellsimulationen, dass der größte Teil der mechanischen Belastung innerhalb eines kontrahierenden Gerinnsels von den Fibrinfaserbündeln ausgeübt wird, die sich zwischen einzelnen Blutplättchen und/oder ihren Clustern erstrecken.

Um die Geschwindigkeit eines einzelnen Filopodenrückzugs korrekt zu erklären, stellen wir fest, dass die Aktomyosinmaschinerie innerhalb der Blutplättchen, die die Zugkräfte erzeugt, energieintensiv und stark ATP-abhängig ist. Mit dem Verbrauch des intrazellulären ATP-Pools nimmt die Kontraktionsfähigkeit der Blutplättchen mit der Zeit ab. Die natürliche Erschöpfung der Blutplättchen führt zu einer allmählichen Abnahme und Aufhebung der Kontraktilität der Blutplättchen7. Ein weiterer Mechanismus, der die Gerinnselkontraktion einschränkt, ist die allmähliche Versteifung des deformierten Fibrins, wodurch das kontrahierende Fibrin zunehmend resistent gegen durch Blutplättchen verursachte Verformungen wird91. Sowohl die energetische Erschöpfung als auch die Fibrinversteifung erklären das Plateau bei der Verdichtung des Fibrinnetzwerks. Das Modell berücksichtigt implizit die Geschwindigkeit des Filopodienrückzugs, indem es die von den Thrombozytenfilopodien erzeugte Kraft berücksichtigt, die wiederum von der Fibrinsteifheit abhängt.

Der Grund für eine beeinträchtigte Gerinnselkontraktion bei (pro)thrombotischen Zuständen ist eine Funktionsstörung und Erschöpfung der Blutplättchen, die eine Folge der kontinuierlichen Blutplättchenaktivierung ist3,4. Eine der Hauptfolgen einer solchen Erschöpfung ist die Refraktärität der Blutplättchen, also die verminderte Fähigkeit, auf einen aktivierenden Reiz zu reagieren. Das Modell erfasst diese Situation, indem es Blutplättchen mit unterschiedlichem Aktivierungsgrad untersucht, einschließlich der verringerten Fähigkeit zur Bildung von Filopodien, was einer teilweisen Refraktärität der Blutplättchen entspricht.

Da der Grad der Thrombozytenaktivierung direkt mit der Anzahl der Thrombozytenfilopodien korreliert, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass eine schwache Thrombozytenaktivierung zu einer beeinträchtigten Gerinnselkontraktion führt. Dies steht im Einklang mit früheren In-vitro-Daten, die zeigen, dass die Abnahme der Thrombinkonzentration von 1 auf 0,5 U/ml und damit das Ausmaß der Thrombozytenaktivierung den Grad und die Geschwindigkeit der Gerinnselkontraktion verringert41. Der dynamische Zusammenhang zwischen der Agonistenkonzentration in einem Gerinnsel und der Anzahl der von einem einzelnen Blutplättchen erzeugten Filopodien ist derzeit nicht bekannt. Wenn eine solche Beziehung in Zukunft entwickelt wird, kann unser Modell möglicherweise entsprechend erweitert werden.

Modellsimulationen mit einer durchschnittlichen Anzahl von 6–7 Filopodien pro Blutplättchen reproduzierten die drei bei Kim et al. beobachteten Kontraktionsphasen. 16 mit ähnlicher Dauer und Fibrinverdichtungsraten. Darüber hinaus sagen Modellsimulationen voraus, dass ein Anstieg der Anzahl der Filopodien auf 12 zu 4 Phasen mit höheren Fibrinverdichtungsraten führt. Andererseits führte eine Verringerung der Anzahl der Filopodien auf 2–3 nur zu einer einzigen Phase mit einer geringeren Fibrinverdichtungsrate. Eine Änderung der Anzahl der Phasen bedeutet eine Änderung der kinetischen Kontraktionsraten. Da eine beeinträchtigte Gerinnselkontraktion mit einer postoperativen tiefen Venenthrombose in Verbindung gebracht wurde4, ergänzen unsere Ergebnisse diese Ergebnisse und legen nahe, dass die Fibrinverdichtung in Gerinnseln dieser TVT-Patienten erheblich verringert werden könnte. Unterdessen war die Anzahl der kinetischen Phasen bei TVT-Patienten im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe unverändert, was auf die Rolle der Thrombozytenerschöpfung bei der beeinträchtigten Gerinnselkontraktion hinweist.

Modellsimulationen quantifizierten auch die möglichen Auswirkungen unterschiedlicher Abhängigkeitsgrade der Filopodien-Zugkräfte auf die Steifheit der Fasern, die Belastungszeit dieser Kräfte sowie die Konkurrenz um Actomyosin zwischen Filopodien desselben Blutplättchens (siehe Abb. 2, Ergänzende Anmerkung). 4.3, Ergänzungstabelle 1 und Ergänzungsabbildung 6) zur Änderungsrate der Fibrindichte eines Gerinnsels während der Kontraktion. Durch die Verfolgung der Blutplättchenclusterung in Simulationen wurde außerdem gezeigt, dass die Bildung von Blutplättchenclustern zu Beginn der Kontraktion an den Rändern stärker ausgeprägt war und sich diese Cluster anschließend in Richtung der Mitte bewegten. Mechanistisch gesehen erfahren Blutplättchen am Rand eines Gerinnsels eine größere Nettoradialkraft als Blutplättchen, die sich näher am Gerinnselzentrum befinden. Infolgedessen ist die Radialgeschwindigkeit der Blutplättchen am Rand des Gerinnsels höher als die der Blutplättchen näher am Gerinnselzentrum. Dieser radiale Geschwindigkeitsgradient für Blutplättchen führt zu ihrer Ansammlung am Gerinnselrand, da Blutplättchen vom Rand im Laufe der Kontraktion Blutplättchen überholen, die sich näher am Gerinnselzentrum befinden.

In dieser Studie wurden 50 μl menschliches Plasma verwendet, um ein mm-großes Gerinnsel zu erzeugen, um dessen Kontraktion in vitro zu untersuchen. 120 × 120 × 35 μm konfokale Mikroskopie-Z-Stapelbilder von Blutgerinnseln wurden während der Blutgerinnselkontraktion aufgenommen und für die Strukturanalyse verwendet. Durch die Durchführung von Simulationen zur schrittweisen Erhöhung der anfänglichen Gerinnselgröße und die Berechnung des endgültigen Ausmaßes der Kontraktion stellten wir fest, dass sich die Ergebnisse nicht wesentlich änderten, als der anfängliche Gerinnselradius ~20 μm erreichte, was darauf hindeutet, dass das Modell eher skalierbar ist und die Ergebnisse auf anwendbar sind Gerinnsel im Makromaßstab. Da die Komplexität des Modells linear mit dem Volumen des simulierten Gerinnsels skaliert, sind Simulationen größerer Gerinnsel möglich, sobald die Architektur für Multi-GPU-Simulationen erstellt wurde. Dieses Simulationsframework befindet sich in der Entwicklung und könnte in Zukunft zur Durchführung von In-silico-Studien an Gerinnseln viel größerer Ordnung verwendet werden.

Der in diesem Artikel beschriebene Multiskalen-Modellierungsansatz kann verwendet werden, um Eigenschaften des Kontraktionsprozesses weiter zu untersuchen, die in Experimenten nicht einfach gemessen werden konnten (siehe Abb. 2). Es ist bekannt, dass einige dieser Eigenschaften entweder von der Stelle abhängen, an der sich die Gerinnsel gebildet haben (z. B. unterschiedliche Faserausrichtungen in verschiedenen Arten von Blutgefäßen, abhängig von den Flussraten) oder Veränderungen bei Patienten mit Bluterkrankungen, wie dem Bernard-Soulier-Syndrom, charakterisiert sind durch Mutationen im GPIb-IX-V-Komplex, begleitet von ungewöhnlich großen Blutplättchen, niedrigen Blutplättchenzahlen und verlängerter Blutungszeit, oder einige angeborene Dysfibrinogenämien, die durch Fibrinogenmutationen gekennzeichnet sind, die zu Veränderungen der Fibrinstruktur und -eigenschaften führen. Sofern die richtigen Daten zur Schätzung der Parameterwerte vorliegen, kann das Multiskalenmodell die in jedem dieser alternativen Szenarien gebildeten Gerinnsel reproduzieren und die Ergebnisse der Simulationen können zur Vorhersage der Gerinnselkontraktion verwendet werden. Dies könnte besonders nützlich sein, um mögliche medikamentöse Behandlungsstrategien für einige der Blutungs- oder Thromboseerkrankungen zu entwickeln, die die Gerinnselkontraktion beeinflussen.

Wir stellen fest, dass das aktuelle Modell keine Erythrozyten umfasst, von denen bekannt ist, dass sie eine wichtige Rolle bei der Bildung und Kontraktion von Blutgerinnseln spielen7,42. Die Kontraktion des Gerinnsels führt zur Verformung der Erythrozyten in dicht gepackte polyedrische Zellen, Polyederozyten oder Piezozyten, die eine undurchlässige Barriere bilden, die für die Blutstillung wichtig ist. Da das Ziel dieser Arbeit darin besteht, den Mechanismus des Ziehens von Blutplättchen am Fasernetzwerk zu bewerten, haben wir Erythrozyten aus unseren Experimenten und Simulationen ausgeschlossen, um die Blutplättchen-Fibrin-Adhäsion und mechanische Wechselwirkungen eindeutig testen zu können. Die Wechselwirkung zwischen Erythrozyten und Fibrinfasern ist passiv in dem Sinne, dass es keine messbare inhärente Kontraktionskraft gibt, die von Erythrozyten auf Fibrin ausgeübt wird. Wir planen, unser Multiskalenmodell in Zukunft um die Darstellung von Erythrozyten wie in der Literatur92,93,94,95 sowie um unser erweitertes Mehrphasen-Submodell96 zu erweitern, um die Kontraktion von Blutgerinnseln mit mehreren Zelltypen zu untersuchen.

Es ist bekannt, dass unter Strömungsbedingungen97 gebildete Fibrinfasernetzwerke eine andere Struktur aufweisen als solche, die unter statischen Bedingungen gebildet werden. Allerdings weisen Fasernetzwerke, die unter statischen Bedingungen in vitro und Strömungsbedingungen in vivo gebildet werden, ähnliche Mechanismen und vergleichbare Ausmaße der Gerinnselkontraktion auf98,99. Da die Experimente, die wir in dieser Arbeit verwendet haben, unter statischen Bedingungen durchgeführt werden (die Reynolds-Zahl ist \(\ll\)1), beziehen wir Fluidströmungsgleichungen daher nicht explizit in unser Modell ein. Dennoch erklären wir die Wechselwirkung der Fibrinflüssigkeit innerhalb des Gerinnsels durch die Einführung einer viskosen Dämpfungskraft und die thermische Fluktuation der Knoten durch die Brownsche Kraft. Wir stellen außerdem fest, dass die Werte der Parameter im aktuellen Modell unabhängig vom Blutfluss sind. Zukünftig werden weitere Modellentwicklungen die Platzierung und Steifheit von Erythrozyten in verschiedenen Regionen des Gerinnsels vor der Kontraktion umfassen, um deren Einfluss auf die Form und Größe des Gerinnsels zu untersuchen. Solche Auswirkungen werden offensichtlich von Werken wie 100 als wichtig erwiesen. Solche Simulationen können Einblicke in den Einfluss der pathologischen Steifheit von Erythrozyten auf die Blutgerinnselkontraktion liefern101, was in vivo schwierig zu untersuchen oder kostspielige Experimente effizienter zu gestalten wäre. Alternativ werden wir unsere Fibrin-Blutfluss-Wechselwirkungsgleichungen erweitern, um eine voreingenommene Driftkraft einzubeziehen, die proportional zur Nähe des Fibrins zur Gerinnseloberfläche ist, wie in der Literatur beobachtet39,96. Studien zu den Auswirkungen des Blutflusses auf die Kontraktion sind bei Tieren schwierig und kostspielig und bei Menschen nicht möglich.

Schließlich könnten die in diesem Artikel beschriebenen Mechanismen und der rechnerische Modellierungsansatz auch auf andere Systeme angewendet werden, in denen Zellen oder Partikel in ein Fasernetzwerk eingebettet sind und auf der Grundlage der Substratsteifigkeit oder anderer mechanischer Eigenschaften Kräfte auf ihre Umgebung ausüben. Beispielsweise reorganisieren Fibroblasten die aus Kollagen und Elastin bestehenden Fasernetzwerke in asthmatischen und gesunden Atemwegen (d. h. Organen des Atemtrakts, die den Luftstrom während der Beatmung ermöglichen). Ein weiteres Beispiel sind Bakterien, die mit einem mykotischen Netzwerk interagieren und daher ähnlich wie Blutplättchen im Fibrinnetzwerk wirken.

Durch Venenpunktion wurde menschliches Blut von gesunden Freiwilligen entnommen, die mindestens 14 Tage lang kein Aspirin oder andere Medikamente eingenommen hatten, die die Thrombozytenfunktion beeinträchtigen. Die Einverständniserklärung wurde nach einem vom Institutional Review Board der University of Pennsylvania genehmigten Protokoll eingeholt. Plättchenreiches Plasma (PRP) wurde aus Vollblut hergestellt, das durch 15-minütige Zentrifugation bei 210 × g und 25 °C in 3,8 % Trinatriumcitrat (9:1 v/v) aufgezogen wurde. Um Fibrin und Blutplättchen zu markieren, wurden die PRP-Proben 10 Minuten lang bei 37 °C mit Alexa-594-markiertem menschlichem Fibrinogen (9 µg/ml) bzw. Calcein (10 µg/ml) vorinkubiert. Um die Gerinnung und Gerinnselkontraktion zu induzieren, wurden PRP-Proben mit CaCl2 (29 mM) erneut verkalkt und mit menschlichem α-Thrombin (1 U/ml, alle Endkonzentrationen) gemischt. Eine aktivierte Plasmaprobe wurde sofort auf eine Mikroskopglasoberfläche einer PELCO-Zellkulturschale in der Umgebungskammer eines konfokalen Mikroskops übertragen. Die Glasoberfläche wurde mit 4 % (v/v) Triton X-100 vorbeschichtet, um die Anhaftung von Fibrin am Glas zu verhindern und eine ungehinderte Gerinnselkontraktion zu ermöglichen.

PRP-Gerinnsel wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Zeiss LSM710 mit Wasserimmersionsobjektiv Plan Apo ×40 (NA1,2) abgebildet, um serielle 35 μm dicke Z-Stapelbilder der Gerinnsel während der Kontraktion (40 Minuten, in Zeitintervallen von 75 Minuten) aufzunehmen S). Der Abstand zwischen den Schichten der Z-Stapelbilder betrug 0,8 μm; Jedes Bild wurde mit einer Auflösung von 1024 × 1024 Pixel aufgenommen. Fluoreszierend markiertes Fibrin und Blutplättchen wurden mit 594-nm-Helium-Neon-Laserstrahlen (Fibrin) und 488-nm-Argon-Laserstrahlen (Blutplättchen) angeregt und bei Emissionswellenlängen von 620 nm (rot) bzw. 515 nm (grün) sichtbar gemacht. Die 3D-Rekonstruktion des Fibrin-Blutplättchen-Netzes wurde mit der Imaris-Software durchgeführt. Die Anzahl der von einzelnen Blutplättchen gebildeten Filopodien wurde manuell in den erfassten konfokalen Mikroskopie-Z-Stapeln kontrahierender PRP-Gerinnsel mithilfe der Open-Source-Fiji-Software gemessen. Um die Anzahl der Filopodien zu berechnen, wurde jedes Bild in 50 quadratische Domänen aus 10 µm dicken Z-Stapeln unterteilt und die Anzahl der Filopodien für jedes einzelne Blutplättchen gezählt. Um Änderungen der Fibrin-Fluoreszenzintensität, der Dichte des Fibrin-Netzwerks und der Kolokalisierung von Blutplättchen mit Fibrin zu verfolgen, wurden Z-Stapel-Bilder der seriellen konfokalen Mikroskopie, die während der Gerinnselkontraktion gesammelt wurden, mit Fiji-Software nachbearbeitet und mit Standard-Fiji-Bildanalysetools quantifiziert16,102,103.

Blutplättchenreiches Plasma (PRP) wurde durch 10-minütige Zentrifugation von Citrat-Vollblut bei 200 g bei Raumtemperatur erhalten. PRP-Proben wurden ohne und mit Blebbistatin (200 µM Endkonzentration) 3 Minuten lang bei 37 °C vorinkubiert. Änderungen der Gerinnselgröße wurden im Laufe der Zeit optisch verfolgt, wie zuvor beschrieben41. Plasmaklumpen wurden in Kunststoffküvetten gebildet, deren Wände mit 1 % Pluronic F-127 (Sigma-Aldrich) vorgeschmiert waren, um ein Anhaften von Fibrin zu verhindern. Um die Gerinnselbildung einzuleiten, wurde citratiertes PRP in einem separaten Kunststoffröhrchen mit 2 mM CaCl2 erneut kalzifiziert, gefolgt von der Zugabe von 1 U/ml Thrombin (beide Endkonzentrationen). Zur Gerinnselbildung und -kontraktion wurden 80-μl-Proben in transparente Kunststoffküvetten überführt, die mit einem optischen Instrument mit CCD-Kamera abgebildet wurden. Veränderungen der Gerinnselgröße während der Kontraktion wurden durch die Aufnahme von Bildern alle 30 Sekunden für 30 Minuten verfolgt. Bildsequenzen wurden rechnerisch analysiert, um kinetische Kontraktionskurven darzustellen und das endgültige Ausmaß der Kontraktion zu messen.

Die Werte der im Modell verwendeten Parameter sind in Tabelle 1 angegeben. Um ein virtuelles Fibrinnetzwerk mit Eigenschaften zu erhalten, die sowohl quantitativ als auch qualitativ denen ähneln, die in den experimentellen Blutplättchen-reichen Plasmagerinnseln beobachtet wurden, haben wir einen Algorithmus zur Generierung einer rechnerischen Dreiergruppe entwickelt. dimensionales Gerinnsel, das sowohl aus Blutplättchen als auch aus Fibrinfasern besteht. Diese Routine verwendet quantitative Messungen, die aus der konfokalen Mikroskopie-Bildgebung von reinem Fibrin27,29 oder Plasmagerinnseln27,29 extrahiert wurden, wie z. B. Faserlängenverteilung, Faserorientierung und Faserdichten. Diese Mengen und die Strukturen der Blutgerinnsel sind für die ordnungsgemäße biologisch relevante Kontraktionsdynamik von Blutgerinnseln von grundlegender Bedeutung. (Der Algorithmus und Einzelheiten seiner Anwendung werden in der Ergänzenden Anmerkung 2.1 beschrieben.)

Simulationen von 10 unabhängig voneinander erzeugten in silico-Gerinnseln bestehend aus Fibrin und aktivierten Blutplättchen wurden durchgeführt und statistisch analysiert. Dies geschah zur Modellvalidierung und Verifizierung der Modellvorhersage. In der Ergänzenden Anmerkung 3 haben wir 3-Grad-Polynomkurven zur Anpassung verschiedener Datensätze verwendet, indem wir eine nichtlineare Routine zur Optimierung der kleinsten Quadrate aus der SciPy-Python-Bibliothek104 durchgeführt haben. Die Fehler (angezeigt durch schattierte Segmente, siehe Abbildungen 7 und 8 im Haupttext und ergänzende Abbildungen 4–6) wurden unter Verwendung der Standardabweichungen in jedem passenden Polynomkoeffizienten berechnet, der durch \({\sigma }_{i}=\ sqrt{{{\rm {co}{v}}}_{{ii}}}\) wobei \({\rm {{co}{v}}}_{{ii}}\) das Diagonalelement ist der berechneten Kovarianzmatrix der optimierten Werte der geschätzten Koeffizienten.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle relevanten unterstützenden Daten sind im folgenden CodeOcean-Repository verfügbar: https://codeocean.com/capsule/4c7bb411-62de-47de-93b4-2c03441d6338/. Die Daten für diese Studie wurden mit den im Dokument beschriebenen Simulationsalgorithmen und dem in der CodeOcean-Kapsel hinterlegten Quellcode generiert. Anweisungen zum Kompilieren des Quellcodes und zum Ausführen von Simulationen zur Reproduktion der im Dokument dargestellten Ergebnisse finden Sie in der README-Datei.

Quellcode, Eingabeskripte, Nachbearbeitungs-Python-Dateien und README-Dateien sind in der CodeOcean-Kapsel verfügbar: https://codeocean.com/capsule/4c7bb411-62de-47de-93b4-2c03441d6338/.

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Referenzen herunterladen

Diese Arbeit wurde teilweise durch das NIH-Stipendium Nr. unterstützt. UO1 HL116330 (SX, ZX, OVK, RIL, JWW, MA), R01 HL146373, HL148227 (JWW, RIL), University of Pennsylvania Research Foundation Grant (JWW), NSF gewährt DMS-2029814 (MA, SB) und DMS-1517293 und NSF-CDS&E-203451 (ZX), American Heart Association Grant 17SDG33680177 und NIH Grant R21DE030294 (OVK). MA wurde teilweise auch durch das NSF-Stipendium DMS 2029814 unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise auch durch die NSF-Auszeichnungen CNS-1730158, ACI-1540112, ACI-1541349, OAC-1826967, das Büro des Präsidenten der University of California und die Universität unterstützt des California Institute for Telecommunications and Information Technology/Qualcomm Institute in San Diego. Wir möchten auch CENIC für die Unterstützung beim Zugang zu den 100-Gbit/s-Netzwerken danken. Die Berechnungen wurden unter Verwendung der Computercluster und Datenspeicherressourcen des UC Riverside HPCC durchgeführt, die teilweise durch den NSF-Zuschuss MRI-2215705 finanziert wurden.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Christian Michael, Francesco Pancaldi.

Fakultät für Mathematik, University of California Riverside, Riverside, CA, 92521, USA

Christian Michael, Francesco Pancaldi, Samuel Britton, Khoi Vo und Mark Alber

Zentrum für quantitative Modellierung in der Biologie, University of California Riverside, Riverside, CA, 92521, USA

Christian Michael, Francesco Pancaldi, Samuel Britton, Khoi Vo und Mark Alber

Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, University of Michigan, Ann Arbor, MI, 48109, USA

Christian Michael

Abteilung für Zell- und Entwicklungsbiologie, University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia, PA, 19104, USA

Oleg V. Kim, Rustem I. Litvinov und John W. Weisel

Abteilung für Biomedizintechnik und Mechanik, Zentrum für weiche Materie und biologische Physik, Virginia Tech, Blacksburg, VA, 24061, USA

Oleg V. Kim

Abteilung für Pharmakologie, University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia, PA, 19104, USA

Alina D. Peshkova

Abteilung für Angewandte und Computergestützte Mathematik und Statistik, University of Notre Dame, Notre Dame, IN, 46556, USA

Zhiliang Xu

Abteilung für Bioingenieurwesen, University of California Riverside, Riverside, CA, 92521, USA

Mark Alber

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MA, FP, CM, OVK, RIL und JWW konzipierten die Arbeit. SB, ZX, FP, CM, OVK und MA haben das Rechenmodell entwickelt. Die experimentelle Datenerfassung wurde von OVK und ADP durchgeführt. Die formale Analyse wurde von OVK, AP, CM, FP, KV und RIL durchgeführt. Modellsimulationen wurden von CM, FP, OVK, ZX, RIL, JWW und MA durchgeführt und interpretiert. Ressourcen wurden bereitgestellt von MA und JWW Alle Autoren haben zum Verfassen ursprünglicher und überarbeiteter Entwürfe beigetragen. Die Projektverwaltung wurde von MA, OVK und JWW überwacht

Korrespondenz mit John W. Weisel oder Mark Alber.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Dieses Manuskript wurde zuvor in einer anderen Nature Portfolio-Zeitschrift rezensiert. Das Manuskript wurde ohne weitere Begutachtung bei Communications Biology als zur Veröffentlichung geeignet erachtet. Hauptredakteur: Gene Chong.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Michael, C., Pancaldi, F., Britton, S. et al. Kombinierte Computermodellierung und experimentelle Untersuchung der biomechanischen Mechanismen der durch Blutplättchen gesteuerten Kontraktion von Fibringerinnseln. Commun Biol 6, 869 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05240-z

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Eingegangen: 14. Juni 2023

Angenommen: 10. August 2023

Veröffentlicht: 24. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05240-z

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